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固相萃取技术及其在生物样本分析中的应用与进展
添加时间:2015-12-15
  近20年来,仪器分析得到了迅猛发展,尤其是计算机和微处理技术的进步,使分析方法自动化成为可能。就生物样本的分析而言,分析过程包括采样、样本贮存、样本制备、待测物的分离和鉴别以及最后的定量分析。在这一系列过程中,样本制备始终是最为复杂、繁琐却又最为关键的一步。因为在此期间,需要对样本进行分离、净化和浓集。目前,最常用的样本制备方法仍是液-液萃取(LLE)的方法。但是,它耗时较长,需要样本的量较大,处理时采用大量有机溶剂,易形成乳化,造成样本的损失。与此同时,由于高效液相色谱,特别是反相高效液相色谱的成功应用,使人们利用色谱理论,采用装有不同填料的小柱进行样本制备的固相萃取(亦称液-固萃取)技术(SPE)日益受到重视。该技术于70年代初引入分析中,它大大缩短了样本制备时间,所需样本量少,避免了乳化现象,而且便于自动化操作,真正实现了生物样本分析的高效率。
  1 、SPE方法
  SPE的基本模式 SPE的基本原理是样品在两相之间的分配,即在固相(吸附剂)和液相(溶剂)之间的分配。其保留或洗脱的机制取决于被分析物与吸附剂表面的活性基团,以及被分析物与液相之间的分子间作用力。有两种洗脱模式,一种是被分析物比所存在的生物介质与固相之间的亲和力更强,因而被保留,然后用一种对被分析物亲和力更强的溶剂洗脱;另一种是存在的生物介质较被分析物与固相之间亲和力更强,则被分析物被直接洗脱。通常使用的为前一种模式。
  SPE方法最早的SPE方法是,将含有被分析物的液相倒入盛有适当吸附剂的器皿中,振摇一定时间,使被分析物在两相间分配达平衡,通过过滤或倾泻的方法实现两相的分离。如果吸附剂有效,则大部分被分析物被吸附于固相,然后再用适当的溶剂使之解吸附即可。
  现代SPE方法采用长约2~3cm的聚丙烯小柱,内装各种填料,两端装有烧结片或多孔圆片,可通过加压或抽负压的方法使液相经过小柱,实验步骤如下:
  第一步:使用甲醇润湿小柱,活化填料,以便固相表面易于和被分析物发生分子间相互作用,同时,可以除去填料中可能存在的杂质。李增标等比较了柱的湿润性对多种药物吸附的影响后指出,C18柱在甲醇含量大于8%的水溶液中才能保持湿润而有利于药物的吸附,否则,将导致回收率的降低。
  第二步:用水或适当的缓冲液冲洗小柱,转移过多的甲醇,以便样本与固相表面发生作用。但清洗不宜过分,否则会使甲醇含量过低,从而导致湿润度不足,回收率降低。
  第三步:加样,使样本经过小柱,弃去废液。
  第四步:用水或适当的缓冲液冲洗小柱,转移样本中的内源性杂质和其他相关杂质。
  第五步:选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物,收集洗脱液,挥干溶剂以备后用或直接进行在线分析。
  以上的操作步骤为分析工作者广泛采用,同时人们正在努力尝试新的技术。为了提高洗脱纯度,缩短溶剂蒸发时间,Liu等将超临界流体萃取技术(SFE)与SPE技术联用,选择ODS柱,操作至第四步后,将填料移至萃取管置于SFE系统的限制器中,然后以CO2-5%甲醇作为超临界流体洗脱分析物,分别采用GC-MS和HPLC分析了狗血浆中痕量的美贝维林醇和黄酮,与SPE方法比较,其回收率略低,但也达到90%左右。
  近年来,SPE技术更加趋于微量化,出现了用于SPE的膜片以及固相微萃取技术(SPME)。SPE膜片技术是将吸附剂固定在一卷微纤维上,置于SPE膜内,其厚度仅为0.5mm,可允许更高流速通过,对于大量的低浓度样本非常实用,可以实现有效的浓集并房与HPLc系统相联,Kwakman以此对水中有机磷杀虫剂进行了在线检测。SPME技术中的固相为一纤维,可以是熔融石英或覆盖聚二甲基硅氧烷的熔融石英,聚酚亚胺,液晶聚丙烯酸酯,聚乙二醇或石墨。该纤维被置于一个微量注射器的针腔内,使用时将针筒推入,则纤维降低,放大样品液中一段时间,在转子搅拌下,药物被吸附,然后将纤维退回进样针内,当迸样针插入GC进样口时,样品发生热解吸附,从而进入分析柱中。Page等采用SPME-顶空GC分析了食物中的挥发性物质。
  2、SPE填料
  可应用于SPE的填料种类繁多,其中,吸附型的有:活性炭,硅胶,硅藻土,硅酸镁,氧化铝等。就化学键合相硅胶而言%
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