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固相萃取柱的实验方法和技巧
添加时间:2015-12-29
  固相萃取柱的选择与分类
  1.1、柱压力方式选择柱压力可分为:减压、加压、常压。减压柱能够减少固定相硅胶的使用量,缺点有:第一,大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发(有时在固相萃取柱外面有水汽凝结);第二,可能会造成易分解物质的损失;第三,抽气泵的使用,会延长过柱萃取时间,增加噪音。固相萃取柱加压是一种较好的使用方式,特别适用于易分解样品的分离。加压可以增加淋洗剂的流动速度,减少产品收集时间,缺点是:第一,减低柱子的塔板数;第二,压力过大,溶剂流速过快减低分离效果,所以柱加压在普通的有机化合物的分离中较适用。其他条件相同时,常压柱效率最高,但耗时,比如天然化合物的分离。
  1.2、固相萃取柱的尺寸选择理想的固相萃取柱类型应该是内径和长度均较大。柱长加大,相应的塔板数则高,柱内径较大,进样后样品的原点则小(反映在柱子上就是样品层较薄),分离度变大。缺点是采用内径较大的萃取柱需较多的硅胶和溶剂,增加实验成本。现在常用萃取柱直径与长度比一般在1:5~1:10,固定相硅胶量是样品量的30~40倍。萃取柱较短内径较小,相应的塔板数则低,进样后样品的原点则大(反映在柱子上就是样品层较厚,样品层在固相萃取柱内小于0.5cm,各组分较容易完全分离),分离度变小。如果所需组分和杂质分离度较大(所需组分分离度R>1),使用硅胶较少、内径较小的萃取柱(例如200毫克的样品,用2cm×20cm的柱子);如果所需组和杂质分离度较小(所需组分分离度R<1),可以加大萃取柱内径,也可使用极性较小的淋洗剂等。
  1.3、无水无氧柱无水无氧柱适用于对氧、水敏感、易分解的产品,可以湿柱,也可以干柱。由于溶剂和硅胶饱和时放出热量可能导致分析样品中化合物的分解,样品过柱前要用溶剂将萃取柱饱和一次。分离较敏感物质,必须选用密封的接收瓶,遵循Schlenk操作,至于是加压、常压、减压,随需而定。氧化铝常用作无水无氧柱的固定相。氧化铝可以做成碱性、中性和酸性的,选择范围较大,但成本较高。硅胶中有大量的羟基裸露在外,样品容易分解,尤其是金属有机化合物和含磷化合物,一般较少使用。
  1.4、关于湿法、干法上样湿法上样操作简单,一般用淋洗剂溶解样品,常用溶剂如二氯甲烷、乙酸乙酯等,为防止溶剂成为淋洗剂,溶剂越少越好。有些样品在上柱前较粘稠,但对结果影响较小,有些浓度较大样品上样后在硅胶上有析出现象,分析原因是硅胶对样品的吸附达到饱和,而样品本身溶解度较低造成的,遇到这种情况应该先重结晶,得到大部分的化合物后再做柱分离,如果不能重结晶,直接过柱,样品随着淋洗剂流动会自动溶解。若有些样品溶解性差,溶解的溶剂又不能上柱(比如DMF、DMSO等,会随着溶剂一起走,显色有个很长的脱尾),此时必须用干法上柱。样品和硅胶的量的比例为1∶1,总量越少越好,分离结果要保证在旋干后,无明显固体颗粒析出(说明有的样品没有吸附在硅胶上)。
  1.5、淋洗剂的选择
  1.5.1淋洗剂的要求
  a.挥发性小,在操作温度下有较低蒸汽压,以免流失;
  b.热稳定性好,在操作温度下不发生分解;
  c.对试样组分有适当的溶解能力;
  d.具有较高的选择性,即对沸点相同或相近的不同物质有尽可能高的分离能力;
  e.化学稳定好,不与被测物质发生化学反应。
  1.5.2淋洗剂的选择
  (1)分离非极性物质,一般选用非极性淋洗剂,这时试样中的各组分按沸点次序先后流出。
  (2)分离极性物质,选用极性淋洗剂,这时试样中的各组分按极性顺序分离,极性较小的先流出,极性较大的后流出。
  (3)分离非极性与极性混合物时,一般选用极性淋洗剂,这时非极性部分先流出,极性部分后流出。
  (4)对于能形成氢键的试样,如醇、酚等的分离,一般选择极性的或是氢键型的淋洗剂,这时各组分按与淋洗剂之间形成的氢键能力大小先后流出。
  (5)对于较难分离的物质,可以用两种或两种以上的淋洗剂。有时我们为了节约成本经常购买大包装或桶装的淋洗剂,这些大多是工业用品,杂质较多,所以在比较严格的柱分时有必要对溶剂重蒸(过原料时就可以节省次步骤)。另外溶剂在过柱子后也回收利用,一方面环保,另一方面也能节约部分经费,缺点是耗时。过柱时石油醚和乙酸乙酯的挥发度不同会导致极性的变化,一般会导致极性变大,此方式较适合梯度淋洗。样品过柱分离后,为防止减压旋蒸时有部分低沸点杂质吸出,溶剂最后回收要采用常压,这时纯化回收效果较好。
  固相萃取柱操作问题
  2.1、装柱柱子下的活塞避免使用润滑剂,以免被淋洗剂带到产品中。干法和湿法装柱区别较小,只要能把柱子装实即可。装柱前应仔细观察固相萃取柱是否开裂,避免影响分离效果,装柱应该要适度紧密(太紧密淋洗剂流速太慢,太疏松淋洗剂流速过快)、均匀(避免样品从一侧斜着流出),避免过柱时出现大量的气泡。
  2.2、加样用少量的溶剂溶样品加样,打开活塞,待溶剂层下降至石英砂面时,再加少量的低极性溶剂,然后再打开活塞,如此三次,一般石英变成白色。加入淋洗剂后不可立即加压,等溶样品的溶剂和样品层有分开2cm~4cm,再加压,这样可以避免溶剂(如二氯甲烷等)夹带样品快速下行。
  2.3、样品的收集用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡过程。如果样品与硅胶的吸附较强,样品解析较慢。这样就会出现后面的点先出,而前面的点后出的现象,这时可以采用氧化铝作固定相。另外,收集的试管大小要以样品量而定,特别是小量样品,如果用大试管,可能一根就收到了多个样品,如果都用小试管,缺点是工作量太大。
  2.4、最后处理萃取柱分离后,由于使用了大量的溶剂,其中的杂质也会积累到所需组分中,必要时进行重结晶。另外,过柱时有时会出现气泡,这可能存在两种原因:一是这与使用的溶剂类型有关,如果是易挥发的溶剂,如乙醚、二氯甲烷等,在室温稍高的情况下,很容易出现这种现象。因此,在室温高的时候,应该选择沸点较高,挥发性相对小的溶剂。使用混合溶剂时,使用的两种溶剂的沸点相似,如:乙酸乙酯和石油醚(60℃~90℃)。二是在装柱之前,柱内可能存有少量空气,必须用加压的方式将空气排干,这样就可避免柱中存有空气。
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