黄曲霉毒素免疫亲和柱

黄曲霉毒素是一种毒性极强的剧毒物质，其危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用。黄曲霉毒素免疫亲和柱以 抗原-抗体特异性反应为基础，将抗体键合在凝胶上，使其与黄曲霉毒素特异性结合，从而实现分离净化的效果。

1、用途：

免疫亲和柱可选择性吸附样品液中的黄曲霉毒素，从而对样 品起到非常针对性的净化作用，过柱净化后的样品液可直接 用于 HPLC 分析或处理后用荧光光度计检测。
亲和柱与 HPLC 或荧光光度计配合使用可达到快速测定的目 的 ，以改善信噪比 ，可提高检测方法的准确度。

2、概述：

黄曲霉毒素是一类真菌（如黄曲霉和寄生曲霉）的有毒的代  谢产物 ，它们具有很强的致癌性 ，主要存在于谷物、花生、 坚果、棉籽、饲料、植物油以及动物组织和血液中。其中黄  曲霉毒素 B1（AFTB1）的毒性、致癌性、污染频率均居首位。

3、原理：

测定的基础是抗原、抗体反应，抗体连接在柱体内，样品中的黄曲霉毒素经过提取、过滤、稀释，然后缓慢的通过黄曲 霉毒素免疫亲和柱，在免疫亲和柱内毒素与抗体结合，之后 洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。用甲醇洗脱黄曲霉毒素 ，然后注入到分析仪器中用于检测。

4、包装组成：

每一个盒中包括各种规格黄曲霉毒素免疫亲和柱及 1份说明书。

5、注意事项：

----请在有效日期内使用免疫亲和柱。
----使用前 ，免疫亲和柱需回至室温（ 22～25℃) 。
----亲和柱2～8℃储存 ，不得冻存；冰箱内建议不要贴壁放 置 ，产品易冻 ，影响性能！
----取样量：根据需要可以适当增加或减少取样量 ，注意提 取液量要相应改变。
----柱容量：400ng ，当样本中待检毒素的含量除以稀释倍 数高于柱容量时 ，需要适当降低上样液的体积 ，重新检测。

----pH：亲和柱的上样溶液 pH 需在 6～8 之间 ，若偏离此 范围需要用盐酸或氢氧化钠调节 pH。
----上机检测时的溶剂与流动相保持一致可以消除溶剂效应 的影响。
----黄曲霉毒素 B1 可致癌 ，应戴手套口罩等防护工具操作。 ----使用过的容器及黄曲霉毒素 B1 溶液最好用次氯酸钠溶 液（ 5%V/V）浸泡过夜。

6、配液：
6.1 提取液 1（ 70%甲醇-水溶液）：70%甲醇-水溶液（V 甲醇：V 水 =70 ：30）：取 700mL 甲 醇 ，加入去离子水定容至 1L。
6.2 提取液 2（ 84%乙腈-水溶液）：84%乙腈-水溶液（V 乙腈：V 水 =84： 16）：取 840mL 乙 腈 ，加入去离子水定容至 1L。
6.3 1%吐温-水溶液：取 1ml 吐温-20 ，加入去离子水并定容至 100mL。
6.4 磷酸盐缓冲溶液（简称 ：PBS）：称取 8.00g 氯化钠、1.20g 磷酸氢二钠（或 2.92g 十二水磷  酸氢二钠）、0.20g 磷酸二氢钾、0.20g 氯化钾 ，用 900mL  水溶解，用盐酸调节 PH 至 7.4±0.1，加水稀释至 1000mL。
6.5 氮吹保护液 ：称取1g丙三醇于10ml离心管 ，用甲醇稀释至10ml。

7、样品处理：

方法一：适用于玉米、小麦等粮食作物 ，坚果、玉米油、花 生油、饲料等样品
----5g±0.01g 样品（固体样品需粉碎，并过 1mm分样筛） 加入 20mL 提取液（ 84%乙腈-水溶液）混匀（必要时可加  入 1g NaCl 以获得更好的提取效果）；
----高速均质(≥10,000r/min）3min，或摇床（200r/min ~  300r/min）剧烈振荡 20min ，离心机（ 6,000r/min）离心 10min ，取上清液备用；
----取 4mL 上清液加入水或 PBS 溶液 46mL 稀释 ，摇匀作 为上样液备用；
----将全部上样液过免疫亲和柱净化。
稀释倍数：1
方法二：适用于面粉、麦芯粉、辣椒、花椒、黄豆酱、芝麻 油及其它植物油、谷草、花生及其制品等样品
----5g±0.01g 样品（固体样品需粉碎，并过 1mm分样筛） 加入 20mL 提取液（ 84%乙腈-水溶液）混匀（必要时可加  入 1g NaCl 以获得更好的提取效果）；
----高速均质(≥10,000r/min）3min，或摇床（200r/min ~  300r/min）剧烈振荡 20min ，用快速定性滤纸过滤 ，收集 滤液或离心机（ 6,000r/min）离心 10min ，收集上清液；  ----取 4mL 滤液或上清液加入水或 PBS 溶液 46mL 稀释， 摇匀作为上样液；
----将全部上样液过免疫亲和柱净化。
稀释倍数：1
方法三：适用于中药（2020 版药典规定的中药材及饮片等） ----15g±0.01g 样品（固体样品需粉碎，并过 1mm分样筛） 加入 3g 氯化钠 ，加入 75mL 提取液 2（ 84%乙腈-水溶液） 混匀；
----高速均质(≥10,000r/min）2min，或摇床（200r/min ~  300r/min）剧烈振荡 20min ，离心机（ 4000r/min）离心5min；
----取 5mL 上清液加入水或 PBS 溶液稀释定容至 50mL（必 要可用 1%吐温-水溶液稀释定容），混匀 ，再用微纤维滤纸 过滤 ，并收集滤液作为上样液；
----取 25mL 上样液过免疫亲和柱净化。
稀释倍数：2
方法四：适用红茶、绿茶、乌龙茶、普洱茶等茶叶样品
----5g±0.01g 样品（固体样品需粉碎，并过 1mm分样筛） 加入 20mL 提取液（ 70%甲醇-水溶液）混匀；
----高速均质(≥10,000r/min）1min，或摇床（200r/min ~  300r/min）剧烈振荡 20min ，用快速定性滤纸过滤 ，收集 滤液；
----取 4mL 滤液或上清液加入水或 PBS 溶液 23mL 稀释， 摇匀作为上样液；
----将全部上样液过免疫亲和柱净化。
稀释倍数：1

8、操作程序：

----取出免疫亲和柱 ，将注射器筒的下端直接穿透亲和柱上方的塞子，完成注射器筒与亲和柱的连接，将其放置在气控操作架上进行固定；
----取适量步骤 7 中处理后的溶液 ，注入到注射器筒中；
----去掉亲和柱下方堵头 ，调节开关 ，使液体以 1～2 滴/秒 的速度流出；
----待液体排干后，用 10mL 水洗涤 2 次，流速 2～3 滴/秒； 对于颜色附着比较深的样品 ，先用 1%Tween-20 水溶液洗 涤 10mL ，再用水洗涤 10mL ，流速 2～3 滴/秒；
采用 HPLC 分析时 ，按以下步骤操作： 洗脱方法一：
----待液体排干后 ，用 1.5mL 甲醇洗脱 ，流速 1 滴/秒 ，收 集洗脱液并用水定容至 2mL；
----洗脱液用 0.22μm 微孔滤器过滤后转移至样品瓶用于
HPLC 分析。 洗脱方法二：
****如果用2mL甲醇洗脱氮吹 ，务必要在氮吹前加入 100ul的氮吹保护液，在50℃下氮气缓缓的将洗脱液吹至近 干 ，用初始流动相定容至1.0ml ，涡旋30s溶解残留物；
----复溶液用0.22μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶用于 HPLC分析。
*每次上样前都要将上次液体完全排干。
*也适用于 GB5009.22-2016、GB/T30955-2014 和药典方法。

9、结果判读：

洗脱方法一：
黄曲霉毒素的含量 =检测浓度×2 ×稀释倍数

洗脱方法二：
黄曲霉毒素的含量 =检测浓度×稀释倍数

10、贮藏条件及有效期：

贮藏条件 ：2~8℃。
有效期：该产品有效期为 18 个月。

注：
在 GB 5009.22-2016《食品安全  国家标准食品中黄曲霉毒素 B 族  和 G 族的测定》中,要求在 50℃下  用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干。 近干程度较难把控。故添加氮吹保  护液来保证氮吹的样本可保持近  干状态 ，从而不会影响回收

相关标准：
GB5009.22-2016《食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》
GB5009.24-2016《食品中黄曲霉毒素M族的测定》满足新国标检出限，更严格质量标准