赭曲霉毒素免疫亲和柱

赭曲霉毒素A在霉变谷物、饲料等中极为常见，它是由多种生长在粮食（小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等）、花生、蔬菜（豆类）等农作物上的曲霉和青霉产生的，对人类和动物的肾脏和肝脏损伤极大。赭曲霉毒素免疫亲和柱可选择性吸附样品提取液中的赭曲霉毒素A，从而对样品液中的赭曲霉毒素A起到非常针对性的纯化作用。

1、用途：
免疫亲和柱可选择性吸附样品液中的赭曲霉毒素 A，从而对 样品起到非常针对性的纯化作用，过柱净化后的样品液可直 接用于 HPLC 分析或氮吹复溶后用 LC-MS/MS 检测。

2、概述：
赭曲霉毒素 A（ OhratoxinA ，OTA），是由曲霉属和青霉属 的某些菌种产生的有毒代谢物，是一种具有强肾脏毒和肝脏 毒的真菌毒素 ，并有致畸、致突变和致癌作用。

3、原理：

测定的基础是抗原、抗体反应，抗体连接在柱体内，样品经 过提取、过滤后，缓慢的通过赭曲霉毒素 A 免疫亲和柱，在 免疫亲和柱内毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没 有被结合的其他无关物质。用 5%乙酸甲醇洗脱赭曲霉毒 素 A ，然后注入到分析仪器中用于检测。

4、包装组成：

每一个盒中包括各种规格的赭曲霉毒素 A 免疫亲和柱及 1份 说明书。

5、需要的材料但盒中不提供：

5.1 设备及耗材
----HPLC/LC-MS/MS ----气控操作架
----空气泵 ----天平
----高速均质器（最高转速≥10,000/min）或摇床 ----粉碎机
----分样筛
----量筒 ：100mL/10mL ----漏斗 ：50mL
----注射器：10mL/20mL  ----移液器或移液管 ：1mL
----均质杯（或 250mL 具塞锥型瓶） -----样品瓶
----快速定性滤纸 ----微纤维滤纸
5.2 试剂
----甲醇（CH3OH）：提取过程用分析纯/洗脱过程用色谱纯 ----氯化钠（ NaCl）：分析纯
----碳酸氢钠（ NaHCO3）：分析纯 ----盐酸（ HCl）：分析纯
----氢氧化钠(NaOH）：分析纯
----吐温-20（ C58H114O26）：分析纯 ----水（ H2O）：蒸馏水或去离子

6、注意事项：
----使用前 ，免疫亲和柱需回至室温（ 22～25℃) 。
----亲和柱2～8℃储存 ，不得冻存；冰箱内建议不要贴壁放 置 ，产品易冻 ，影响性能！
----请在有效日期内使用免疫亲和柱。
----须排空亲和柱内液体再进行上样操作。
----取样量：根据需要可以适当增加或减少取样量 ，注意提 取液量要相应改变。
----柱容量：柱容量是 200ng，当样本中待检毒素的含量除 以稀释倍数高于柱容量时，需要适当降低上样液的体积，重 新检测。
----pH：亲和柱的上样溶液 pH需在 6～8 之间 ，若偏离此 范围需要用盐酸或氢氧化钠调节 pH。
----上机检测时的溶剂与流动相保持一致可以消除溶剂效应 的影响。
----赭曲霉毒素可致癌 ，应戴手套口罩等防护工具操作。
---- 使 用 过 的 容 器 及 标 准 品 溶 液 最 好 用 次 氯 酸 钠 溶 液 （5%V/V）浸泡过夜。

7、试液的配置：

7.1 提取液 Ⅰ（用于粮食类样品、辣椒和辣椒制品及酱油、 醋类样品的提取）：80%甲醇-水溶液（V 甲醇:V 水 =80:20）：取 800mL 甲醇， 加入去离子水定容至 1L。
7.2 提取液Ⅱ（用于酒类样品的提取）：称取 150g 氯化钠、20g 碳酸氢钠溶于约 950mL 水中 ，加 水定容至 1L。
7.3 清洗缓冲液（用于酱油、醋类样品净化步骤的洗涤）称 取 12.5g 氯化钠、2.5g 碳酸氢钠溶于水中 ，加 0.1mL 吐温 -20 ，用水定容至 1L。
7.4 冲洗液（用于酒类样品净化步骤的洗涤）：称取 25g 氯化钠、 5g 碳酸氢钠于约 950mL 水中 ，加水定 容至 1L。
7.5 洗脱液（用于所有样品过柱后洗脱）甲醇:乙酸 =95:5， 根据需要量配制。
7.6 磷酸盐缓冲溶液（简称 ：PBS）：称取 8.00g 氯化钠、1.20g 磷酸氢二钠（或 2.92g 十二水磷  酸氢二钠）、0.20g 磷酸二氢钾、0.20g 氯化钾 ，用 900mL  水溶解，用盐酸调节 PH 至 7.4±0.1，加水稀释至 1000mL。

8、样品处理：

方法一：粮食类
----25g±0.01g 样品（固体样品需粉碎，并过 2mm分样筛）， 5g 氯化钠于三角瓶中 ，加入 100mL 的提取液 Ⅰ（见 7.1）； ----高速均质(≥10,000r/min）3min（或用摇床 200r/min ~   300r/min 剧烈振荡 30min）；
----用快速定性滤纸过滤 ，收集滤液；
----取 10mL 滤液加入 40mLPBS 稀释 ，混匀；
----用玻璃纤维滤纸过滤 ，并收集滤液作为上样液； ----取 20mL 上样液过免疫亲和柱净化。
稀释倍数 ：1
方法二：辣椒及其制品
----称取样品 5.0g,加入 1.0g 氯化钠，加入提取液 Ⅰ（见 7.1） 定容至 20ml,混匀；
----涡旋混匀 30 分钟。然后转移至离心机 6000r/min,室温， 离心 10 分钟；
----移取上述上清液 10ml 于离心管中，加 PBS 定容至 50ml， 混匀（如果必要 ，可在此步骤重复进行一次离心），备用；
----准确移取 10ml 上样液过免疫亲和柱净化。
稀释倍数：2
方法三：酒类
----取脱气的酒类样品（含二氧化碳的酒类样品 ，使用前先  搅拌或超声脱气）或不含二氧化碳的酒类样品 20g±0.01g， 加入提取液Ⅱ（见 7.2）定容至 25mL；
----高速均质(≥10,000r/min）1min（或用摇床 200r/min ~ 300r/min 剧烈振荡 20min）；
----用微纤维滤纸过滤至滤液澄清，并收集滤液作为上样液； ----取 1mL 上样液过免疫亲和柱净化。
稀释倍数 ：1.25
方法四：酱油、醋类样品
----取样品 25g±0.01g，加入提取液 Ⅰ（见 7.1）定容至 50mL； ----高速均质(≥10,000r/min）1min（或用摇床 200r/min ~    300r/min 剧烈振荡 20min）；
----用快速定性滤纸过滤 ，收集滤液；
----移取 10mL 滤液用 PBS 定容至 50mL；
----用微纤维滤纸过滤至滤液澄清，并收集滤液作为上样液； ----取 10mL 上样液过免疫亲和柱净化。
稀释倍数 ：1

9、操作程序：
9.1 上样
----取出免疫亲和柱 ，将注射器筒的下端直接穿透亲和柱上 方的塞子，完成注射器筒与亲和柱的连接，将其放置在气控 操作架上进行固定；
----排空亲和柱内液体后 ，取步骤 8 中上样液 ，注入到注射 器筒中；
----使液体以 1~2 滴/秒的速度流出；
9.2 洗涤
----待液体排干；
----净化样品为粮食类时 ，用 10mL 水淋洗免疫亲和柱 ，流 速 2~3 滴/秒；
----净化样品为辣椒及辣椒制品时 ，依次用 10mLPBS 溶液 （见 7.6），10mL 水淋洗免疫亲和柱 ，流速 2~3 滴/秒；
----净化样品为酱油、醋类时，依次用 10mL 清洗缓冲液（见 7.3），10mL 水淋洗免疫亲和柱 ，流速 2~3 滴/秒；
----净化样品为酒类样品时 ，依次用 10mL 冲洗液（ 7.4）， 10mL 水淋洗免疫亲和柱 ，流速 2~3 滴/秒；
9.3 洗脱
----待液体排干后 ，取下针筒 ，用洗耳球将亲和柱吹干 ，上  样 2mL 洗脱液（见 7.5），用试管接洗脱液 ，流速 1 滴/秒， 收集洗脱液：
----45℃下氮吹至近干 ，用流动相复溶至 1ml。
----洗脱液用 0.22μm 微孔滤器过滤后转移至样品瓶用于 HPLC 分析。
*每次上样前都要将上次液体完全排干。
*也适用于 GB5009.96-2016 和 GB/T30957-2014。

10、结果判读：

赭曲霉毒素 A 的含量 =检测浓度×稀释倍数

11、贮藏条件及有效期：
贮藏条件 ：2~8℃。
有效期：该产品有效期为 18 个月。