维生素B12（VB12）免疫亲和柱

1、用途：
免疫亲和柱可特异性选择吸附样品液中的 VB12 ，从而对 基质复杂的样品中的 VB12 起到针对性的净化作用，过柱净化后的样品可直接用于 HPLC 或 LC-MS 分析。
亲和柱与 HPLC 或LC-MS 配合使用可达到快速测定的目的，以改善信噪比，可提高检测方法的准确度。

2、概述：
VB12，别名氰钴胺素、抗恶性贫血维生素等，是一种重要的B族维生素，摄取不足可能引起恶性贫血、精神不振等疾病。

3、原理：
测定的基础是抗原与抗体反应，抗体连接在柱体内，样品经过提取、离心、过滤，缓慢的通过VB12免疫亲和柱，在免疫亲和柱内 VB12 与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有 被结合的其他杂质。洗脱 VB12 ，经氮气吹干复溶后注入到分析仪器中检测。

4、包装组成：
每一个盒中包括 VB12 免疫亲和柱、1 份说明书及质控报告。

5、注意事项：
----使用前，免疫亲和柱需回至室温（22～25℃) 。
----亲和柱 2～8℃储存，不得冻存。
----不要使用过了有效日期的免疫亲和柱。
----取样量：根据需要可以适当增加或减少取样量，注意提取液量要相应改变。
----柱容量：1000ng，当样本中待检 VB12 的含量除以稀释倍数高于柱容量时，需要适当降低上样液的体积，重新检测。
----在重力作用下过柱或用气控操作架控制流速为 1.5-2mL/min。 ----上机检测时的溶剂与流动相一致可消除溶剂效应的影响。
----操作时要穿防护服、戴长筒胶皮手套、护目镜、 口罩和帽子。实验中会释放有毒气体氢氰酸，反应完的废液中可加入次氯酸钠溶液，处理后再排放；所有接触过的器皿、 手套建议用 4%次氯酸钠浸泡处理。保证溶液的碱性环境，24 小时后，用氰基检测试纸检查。

6、配制溶液：
6.1 乙酸钠缓冲液（ 0.25M pH4.0）：
----称取 20.5g 无水乙酸钠 ，加入 950mL 去离子水溶解， 用乙酸调节 pH 至 4.0±0.1 ，再加入去离子水定容至 1L。

6.2 氢氧化钠溶液（ 1M）：
----1M：称量 4g 氢氧化钠，加入去离子水溶解并定容 至 100mL。

6.3 1%氰化钾溶液：
----称取 1g 氰化钾，用去离子水溶解并定容至 100mL。
注意：做好防护措施。

7、样品处理

7.1   保健食品（矿物质片剂、胶囊、粉剂）
----取 20 粒片剂或者胶囊样品粉碎混合均匀，粉剂样品取 5-10 包混合均匀。
----称取 5-10g 样品于 50mL 容量瓶中，加入 30mL 去离 子水，振荡混匀，超声提取 15min，如样品溶液的 pH 大 于 7.0 ，加入乙酸调 pH 至 5~7 ，如样品溶液的 pH 小于 6.0，用 1M 氢氧化钠溶液调 pH 至 5~7，然后用去离子水 定容至 50mL；
----将样品转移至离心管中 ，于 4000rpm 离心 10min；  ----取上层用 Whatman934-AH 滤纸或相当者过滤，收集 滤液。
----取 10-20mL 滤液过免疫亲和柱净化。

7.2   含添加  VB12  的婴幼儿奶粉、辅食和牛奶及含乳饮料
----称取 5-10g （ mL） 的均质样品加入 30mL 0.25M pH4.0 乙酸钠缓冲液，混匀（推荐牛奶及含乳饮料称样量 30g（ mL））；
---- 高 速 均 质 ( ≥ 10,000r/min ） 1min ， 或 摇 床 （200r/min~300r/min)剧烈振荡 20min，
----转移样品溶液至 100mL 棕色容量瓶，用去离子水定容 至刻度并混匀；
----将样品转移至离心管中 ，于 4000rpm 离心 10min；  ----取中间层用 Whatman934-AH 滤纸或相当者过滤，收 集滤液。
----取 20-30mL 上清液过免疫亲和柱净化。

7.3   婴幼儿奶粉、辅食(包括原生和添加VB12
----称取5-10g 的均质样品到100 mL 旋盖棕色瓶中； ----加入30mL 0.25MpH4.0   乙酸钠缓冲液；
----加入 2g 胃蛋白酶，0.5g α-淀粉酶，2mL 1%氰化钾溶液， 磁力搅拌 10min；

----在37℃振荡水浴中孵育30min；   ----转移样品至 100℃,孵育 30min；
----将样品冷却至室温，转移样品至 100mL 棕色容量瓶， 并用去离子水定容至刻度并混匀；
----将样品转移至离心管中 ，于 4000rpm 离心 10min； ----取中间层用 Whatman934-AH 滤纸或相当者过滤， 收集滤液。
----取 20-30mL 上清液过免疫亲和柱净化。

7.4   牛奶及含乳饮料（包括原生和添加 VB12）
----称取 30g（ mL）均质好的样品至 100mL 旋盖棕色瓶 中；
----加入 30mL   0.25MpH4.0  乙酸钠缓冲液；
----加入 1g 胃蛋白酶，0.25g  α-淀粉酶，1mL 1%氰化钾 溶液 ，磁力搅拌 10min；
----在 37℃振荡水浴中孵育 30min； ----转移样品至 100℃,孵育 30min；
----将样品冷却至室温 ，转移样品至 100mL 棕色容量瓶， 并用去离子水定容至刻度并混匀；
----将样品转移至离心管中 ，于 4000rpm离心 10min； ----取中间层用 Whatman 934-AH 滤纸或相当者过滤， 收集滤液。
----取 10-30mL 上清液过免疫亲和柱净化。

7.5   维生素功能饮料和碳酸饮料 维生素功能饮料（澄清状态）：
----称取 40g（mL）维生素功能饮料，用 1M 氢氧化钠溶 液调 pH 至 5~7 ，用去离子水定容至 50ml；
----用 Whatman934-AH 滤纸或相当者过滤 ，收集滤液 （若样本澄清可忽略过滤步骤）。
----取 20-40mL 滤液过免疫亲和柱净化。 碳酸饮料：
----称取 40g（ mL）碳酸饮料 ，超声脱气 10min；
----用 1M 氢氧化钠溶液调 pH 至 5~7 ，用去离子水定容 至 50ml；
----用 Whatman934-AH 滤纸或相当者过滤 ，收集滤液 （若样本澄清可忽略过滤步骤）。
----取 20-40mL 滤液过免疫亲和柱净化。

7.6   果汁类  澄清状果汁：
----称取 40g（ mL）样品，用 1M 氢氧化钠溶液调 pH 至5~7 ，用去离子水定容至 50mL；
----用 Whatman 934-AH 滤纸或相当者过滤，收集滤液（若 样本澄清可忽略过滤步骤）。
----取 20-40mL 滤液过免疫亲和柱净化。 （含果粒的）黏稠状或浓缩果汁：
----先均质试样，然后称取 40g（mL）样品，用 1M 氢氧化钠溶液调 pH 至 5~7 ，用去离子水定容至 50mL； ----将上述样品用去离子水稀释 3-5 倍；
----将样品转移至离心管中 ，于 8000rpm 离心 10min；
----取上清液用 Whatman 934-AH 滤纸或相当者过滤 ，收 集滤液。
----取 30-40mL 上清液过免疫亲和柱净化。

7.7   肉及肉制品（包括原生和添加 VB12）
----称取 5-10g 的均质样品到 100mL 旋盖棕色瓶中； ----加入 30mL   0.25MpH4.0   乙酸钠缓冲液；
----加入 2g 胃蛋白酶，0.5gα-淀粉酶，2mL1%氰化钾溶液， 磁力搅拌 10min；
----在 37℃振荡水浴中孵育 10h-16h； ----转移样品至 100℃,孵育 30min；
----将样品冷却至室温 ，转移样品至 100mL 棕色容量瓶， 并用去离子水定容至刻度并混匀；
----将样品转移至离心管中 ，于 4000rpm 离心 10min；
----取中间层用 Whatman934-AH 滤纸或相当者过滤 ，收 集滤液。
----取 20-30mL 上清液过免疫亲和柱净化。
注：如遇特殊样本（堵柱或净化效果差）以及说明书中未包括到的样本， 可与我司联系。

8、操作程序

----取出免疫亲和柱 ，将注射器筒的下端直接穿透亲和柱上 方的塞子，完成注射器筒与亲和柱的连接，将其放置在气控 操作架上进行固定；
----取适量步骤7中处理后的溶液 ，注入到注射器中；
----调节气控操作架开关 ，使液体以1～2滴/秒的速度流出； ----待上样完毕（上样液与筛板齐平），用水洗涤20mL ，流  速2～3滴/秒；
----排干上述步骤的残留液，取3mL甲醇洗脱，控制流速为1 滴/秒 ，收集洗脱液。
----于 60℃加热条件下氮气吹干，然后用0.5mL流动相复溶； ---- 复溶液用0.22μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶中用于HPLC或LC-MS等仪器分析。
*也适用于GB 5009.285-2022和GB/T 5009.217-2008。

9、贮藏条件及有效期：
贮藏条件：2～8℃。
有效期：该产品有效期为18个月。