肝素免疫亲和柱

1、用途

肝素亲和柱可特异吸附乳铁蛋白，试样中铁蛋白经缓冲 液提取 ，用肝素亲和柱净化后的样品液可直接用于HPLC分析。
肝素亲和柱与HPLC配合使用可达到快速测定的目的， 以改善信噪比 ，可提高检测方法的准确度。

2、概述

乳铁蛋白（ Lactoferrin, Lf）是一种主要存在于哺乳动物乳汁中的糖蛋白，相对分子量约为80KDa，乳铁蛋白在体 内不仅参与铁的转运，还具有抗菌、抗病毒、抗氧化和免疫调节的功能。被认为是一种新型的抗菌、抗癌药物和具有开发潜力的食品和饲料添加剂。目前已被广泛添加于婴幼儿食品中。

3、原理

肝素免疫亲和柱能够特异性的纯化样品中的乳铁蛋白， 样品前处理后，通过免疫亲和柱净化，乳铁蛋白特异性吸附在亲和柱上，用淋洗液将免疫亲合柱上的杂质除去，用洗脱液通过分离柱，将乳铁蛋白亲和柱上分离下来，最后，将洗脱液注入HPLC或LC-MS进行测定。

4、包装组成

每一个盒中包括各种规格的肝素亲和柱及1份说明书。

5、注意事项

----使用前 ，亲和柱需回至室温（ 18～25℃)  。
----亲和柱2～8℃储存 ，不得冻存；冰箱内建议不要贴壁放置 ，产品易冻 ，影响性能！  
----取样量：根据需要可以适当增加或减少取样量 ，注意提取液量要相应改变。
----柱容量：5mg ，当样本中待检乳铁蛋白的含量除以稀释倍数高于柱容量时 ，需要适当降低上样液的体积，
----样品的净化过程中勿将亲和柱内的液体抽干 ，避免气体进入到亲和柱的填料中。
----三氟乙酸挥发性、腐蚀性较强 ，使用过程中注意防护。

6、配制溶液：

6.1 磷酸盐缓冲液 Ⅰ（洗脱液）：称取7.1g磷酸氢二钠、58.4g 氯化钠,加900mL水溶解,用磷酸调pH至8.0±0.2,加水定容 至1000mL。
6.2 磷酸盐缓冲液Ⅱ（提取液）：称取30.1g十二水合磷酸氢 二钠， 2.5g二水合磷酸二氢钠,加900mL水溶解,然后加入 20ml乳铁蛋白提取试剂,加水定容至1000mL。
6.3 磷酸盐缓冲液Ⅲ（淋洗液）：称取30.1g十二水合磷酸氢二钠 ，2.5g二水合磷酸二氢钠,加900mL水溶解并定容至 1000mL。
6.4 磷酸盐缓冲液Ⅳ（国标提取液）：称取71.6g十二水合磷酸氢二钠（或28.4g磷酸氢二钠），加入900mL去离子水溶解并用磷酸调pH至7.5±0.2，最后用水定容至1000mL。

7、样品处理：

固态试样(调制乳粉、乳基婴幼儿配方食品
方法一（同国标方法）：
----称取2.5g(精确至0.01g)试样于烧杯中,加入温热(温度不超过50℃)的磷酸盐缓冲液Ⅳ,搅拌使样品溶解,冷却至室温。
----分次将样品转移至50mL容量瓶并用磷酸盐缓冲液Ⅳ 定容至刻度,充分混匀后转入离心管中 ，取40.0mL溶液在 4 ℃条件下10000r/min离心8min,取10ml上清液作为上 样液待净化。
稀释倍数 ：2

方法二：
----称取2.5g(精确至0.01g)试样于烧杯中,加入温热(温度 不超过50℃)的磷酸盐缓冲液Ⅱ,搅拌使样品溶解,冷却至室 温。
----分次将样品转移至50mL容量瓶并用磷酸盐缓冲液Ⅱ 定容至刻度,充分混匀后转入离心管中 ，取40.0mL溶液在 4 ℃条件下10000r/min离心8min,取10ml上清液作为上 样液待净化。
稀释倍数 ：2

液态试样(巴氏杀菌乳、调制乳、含乳饮料)
方法一（同国标方法）：
----称取5g(精确至0.01g)试样于烧杯中,加入适量磷酸盐缓冲液Ⅳ提取,分次将样品转移至25mL容量瓶,用磷酸盐缓冲液Ⅳ定容至刻度。
----充分混匀后转入离心管,在4℃条件下10000r/min离心8min,取10ml上清液作为上样液待净化，
稀释倍数 ：0.5

方法二：
----称取5g(精确至0.01g)试样于烧杯中,加入适量磷酸盐缓冲液Ⅱ提取,分次将样品转移至25mL容量瓶,用磷酸盐缓冲液Ⅱ定容至刻度。
----充分混匀后转入离心管,在4℃条件下10000r/min离心8min,取10ml上清液作为上样液待净化，
稀释倍数 ：0.5

含水解蛋白跟乳清蛋白的配方奶粉
----称取0.5g(精确至0.01g)试样于烧杯中,加入适量磷酸盐缓冲液Ⅱ提取,分次将样品转移至50mL容量瓶,用磷酸盐缓冲液Ⅱ定容至刻度。
----充分混匀后转入离心管,在4℃条件下10000r/min离心8min,取20ml上清液作为上样液待净化。
稀释倍数 ：5

8、操作程序：

----取出免疫亲和柱 ，3mL的免疫亲和柱将注射器筒的下端直接穿透亲和柱上方的塞子 ，完成注射器筒与亲和柱的 连接 ，将柱子与气控操作架上的注射器连接固定， 12ml 直接拔掉上盖；
----去掉亲和柱下方堵头（洗脱需使用 ，勿丢弃） ，调节开关 ，使液体以1滴/秒的速度流出；
----肝素亲和柱先用10mL磷酸缓冲液Ⅱ活化 ，取7中上样液过柱；
----固态试样(调制乳粉、乳基婴幼儿配方食品及液态试样(巴氏杀菌乳、调制乳、含乳饮料)用10mL磷酸缓冲液Ⅳ淋 洗，用5mL磷酸缓冲液Ⅰ洗脱，收集洗脱液，用磷酸缓冲液 Ⅰ定容至5mL ，涡旋混匀 ，过微孔滤膜后待测；
----含水解蛋白跟乳清蛋白的配方奶粉用20mL磷酸缓冲 液Ⅲ淋洗 ，用5mL磷酸缓冲液Ⅰ洗脱 ，收集洗脱液 ，用磷酸缓冲液Ⅰ定容至5mL ，涡旋混匀 ，过微孔滤膜后待测；

9、结果判读：

肝素的含量 =检测浓度×稀释倍数× 5

10、 贮藏条件及有效期：

贮藏条件 ：2～8℃。
有效期：该产品有效期为18个月。

11、  亲和柱再生：

11.1 亲和柱洗脱完毕至再生，期间应放置入2-8℃环境中， 时间不超过30分钟。
11.2 依次使用10mL磷酸缓冲液 Ⅰ ,  10mL磷酸缓冲液Ⅲ , 10mL纯水 ，10mL20%乙醇淋洗亲和柱。
11.3 加入3mL20%乙醇并塞住亲和柱两端开口，于2-8℃ 环境中保存。
11.4 该亲和柱可至少再生2次。